• 病毒RNA提取实验
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    病毒RNA提取实验


    病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒复制机制研究;(2)用于反向遗传学研究;(3)用于分子病毒学其他研究。

    详细

    实验方法

    实验方法
    • TE-饱和酚/氯仿提取法

    实验方法原理大多植物病毒RNA 为单链RNA ,并且其极性与mRNA 极性相同,植物病毒RNA 提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 
    实验材料
    试剂、试剂盒
    仪器、耗材
    抗体
    实验步骤
    一、实验材料准备

    1.  材料
     
    提纯TMV病毒液(10 mg/ml)。
     
    2.  设备
     
    冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。
     
    3.  试剂
     
    TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA 酶的双菌水。
     
    二、操作步骤
     
    1.  取一eppendorf管加入提纯TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12 000 g离心10分钟。
     
    2.  吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
     
    3.  吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12 000 g离心10分钟。
     
    4.  取水相,加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
     
    5.  4℃下12 000 g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12 000 g离心5分钟。
     
    6.  小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。
     
    7.  取10 ml进行电泳分析。
     
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    注意事项
    1.  整个操作应尽可能在低温下进行。
     
    2.  由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

     

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